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Formatos de entrada

get_MNV necesita tres archivos: llamadas de variantes, un FASTA de referencia y anotación de genes. El archivo BAM es opcional.

1. Llamadas de variantes

Pasa las llamadas de variantes con:

--vcf <VCF_FILE>
# o
--tsv <IVAR_TSV_FILE>

Las entradas de llamadas de variantes admitidas son:

  • VCF (.vcf o .vcf.gz)
  • TSV de variantes de iVar (.tsv)

Usa --vcf para archivos .vcf simples o .vcf.gz comprimidos con BGZF, y --tsv para archivos variants.tsv de iVar. La entrada BCF no se acepta directamente; conviértela antes, por ejemplo con bcftools view input.bcf > input.vcf. Los comandos antiguos que pasan un TSV de iVar mediante --vcf se siguen detectando de forma automática cuando la cabecera tiene las columnas estándar de iVar.

VCF

Usa un archivo VCF estándar que contenga llamadas SNV/MNV, indels o alelos complejos.

Requisitos:

  • Los nombres de contig del VCF deben coincidir con los del FASTA y los del GFF/GTF.
  • Los alelos REF deben coincidir con la secuencia del FASTA.
  • Los registros multialélicos deben dividirse previamente, o bien hay que ejecutar con --split-multiallelic.

get_MNV puede leer las métricas originales de profundidad y frecuencia desde campos INFO o FORMAT habituales, como DP, AF, FREQ, AD, AO y RO.

Estos valores de frecuencia de entrada se conservan en el informe como OFREQ. Los filtros de frecuencia de la línea de comandos (--min-snp-frequency, --min-mnv-frequency) usan en su lugar el soporte de lecturas derivado del BAM, por lo que requieren --bam.

TSV de iVar

Usa el TSV generado por ivar variants.

Columnas obligatorias:

Columna Significado
REGION Nombre del contig
POS Posición en base 1
REF Base de referencia
ALT Base alternativa

Columnas opcionales que se usan cuando están presentes:

Columna Se usa como
TOTAL_DP Profundidad original (ODP)
ALT_FREQ Frecuencia original (OFREQ)
REF_DP, ALT_DP Sirven para inferir profundidad y frecuencia si hace falta
PASS Sirve para conservar las filas que pasan el filtro

Filtrado:

  • Si existe PASS, get_MNV conserva los valores con sentido verdadero, como TRUE, PASS, 1 o YES.
  • Las filas donde REF == ALT se descartan.
  • La notación de indels de iVar como +SEQ o -SEQ se convierte en alelos anclados al estilo VCF usando la referencia FASTA y, a continuación, se analiza con el mismo modelo de eventos de alelo que la entrada VCF.
  • ALT_FREQ se incluye en el informe como frecuencia original (OFREQ), y es independiente de los filtros de frecuencia derivados del BAM.

2. FASTA de referencia

Pasa la referencia con:

--fasta reference.fasta

Requisitos:

  • Los IDs de registro del FASTA deben coincidir con los nombres de contig de las variantes.
  • Las bases deben ser bases de ADN IUPAC válidas.
  • No se admiten nombres de contig duplicados.

3. Anotación de genes

Proporciona --gff o --genes.

GFF/GFF3/GTF

Recomendado para la mayoría de los conjuntos de datos:

--gff genes.gff3

Por defecto, get_MNV analiza las features gene,pseudogene. Para la anotación de codones de regiones codificantes de proteínas, usa:

--gff-features CDS

Detalles importantes:

  • Las coordenadas se leen de las columnas 4 y 5.
  • La hebra se lee de la columna 7.
  • En las features CDS, se usa la fase de la columna 8 cuando está presente.
  • En las filas CDS con transcript_id o Parent, get_MNV construye la secuencia CDS empalmada de cada transcrito. La agrupación de codones, los efectos sobre el aminoácido de los MNV y el contexto de frameshift de los indels se evalúan entonces sobre el CDS completo del transcrito.
  • Si un GFF/GTF contiene varios transcritos para el mismo gen, una sola variante puede producir una línea de salida por cada transcrito solapante. Cada uno se anota por su cuenta, que es la respuesta honesta cuando la anotación ofrece varios. Si quieres una línea por variante, deja un solo transcrito por gen en el GFF antes de ejecutar, por ejemplo con agat_sp_keep_longest_isoform.pl de AGAT.

Los nombres de genes se leen de atributos habituales como gene_name, gene, Name, locus_tag, gene_id e ID.

Anotación TSV simple

Usa --genes para un archivo de anotación pequeño y sencillo:

--genes genes.tsv

Formato de cuatro columnas:

GeneName    GeneStart   GeneEnd Strand

Ejemplo:

Rv0007_Rv0007   9914    10828   +
Rv0008c_Rv0008c 11874   12311   -

Formato opcional de cinco columnas con fase:

GeneName    GeneStart   GeneEnd Strand  Phase

La fase puede ser 0, 1, 2 o .. Si se omite la columna de fase, toma el valor 0 por defecto.

Formato opcional de seis columnas con biotipo:

GeneName    GeneStart   GeneEnd Strand  Phase   Biotype

Rv0007_Rv0007   9914    10828   +   0   protein_coding
mcr11_RVnc0013  1413094 1413224 -   0   ncRNA

Los valores aceptados son protein_coding, coding, CDS y mRNA para features que se traducen, y ncRNA, rRNA, tRNA, tmRNA, miRNA, snRNA, snoRNA, misc_RNA, antisense_RNA, SRP_RNA, RNase_P_RNA, non_coding y pseudogene para las que no. Cualquier otro valor se rechaza con un error en vez de adivinarse, porque adivinar mal inventa una proteína o esconde una real.

Una feature no codificante se reporta contra su gen como non_coding_transcript_exon_variant (MODIFIER), sin cambio de aminoácido. Si se omite la columna de biotipo se asume que toda feature es codificante, que es lo que han hecho siempre los ficheros de cuatro y cinco columnas: un gen de RNA se traduce entonces como si fuera una proteína. Declara el biotipo cuando tu anotación contenga features no codificantes.

La entrada GFF y GTF lo dice por sí sola. Decide el atributo gene_biotype, biotype o transcript_biotype del registro, leído con el mismo vocabulario que la columna de arriba; y si no lo trae, decide el tipo de feature de la columna 3, así que las filas rRNA, tRNA, ncRNA y pseudogene se leen como no codificantes sin necesidad de decírselo. Una feature que no dice nada de sí misma se asume codificante, que es lo que es una fila gene bacteriana. Ten en cuenta que la lista por defecto de --gff-features es gene,pseudogene, así que los pseudogenes entran por defecto y no se traducen.

Limitaciones de la anotación TSV:

  • No tiene columna de contig.
  • Para datos multi-contig, usa GFF/GTF o limita la ejecución con --chrom.

4. Lecturas BAM (opcional)

Pasa las lecturas BAM con:

--bam reads.bam

Cuando se proporciona un BAM, get_MNV calcula:

  • El soporte de lecturas de los SNP
  • El soporte de lecturas del haplotipo MNV
  • La profundidad total y la frecuencia
  • Los recuentos por hebra directa e inversa
  • Estadísticas opcionales de sesgo de hebra

Requisitos:

  • El BAM debe estar ordenado.
  • El BAM debe estar indexado (.bai).
  • Los nombres de contig del BAM deben coincidir con los del archivo de variantes y los del FASTA.
  • Las lecturas duplicadas, secundarias, suplementarias y marcadas como QC-fail se ignoran, igual que las descarta samtools mpileup por defecto.

Nombres de contig

Todos los archivos de entrada deben coincidir en los nombres de contig:

variant contig == FASTA record ID == GFF sequence ID == BAM reference name

Por ejemplo, chr1 y 1 son nombres diferentes. Renombra o normaliza las entradas antes de ejecutar get_MNV.