Alcance y compatibilidad¶

De qué se responsabiliza get_MNV al anotar indels y MNV, qué deja en manos de tu llamador de variantes, y dónde están sus límites.

get_MNV es un anotador de variantes y un generador de resúmenes de haplotipos para llamadas de variantes ya existentes. No reemplaza a un llamador de variantes: el VCF o el TSV de iVar de entrada sigue siendo el responsable de decidir qué alelos existen. Cuando se proporciona un BAM, get_MNV usa la evidencia de las lecturas para contar el soporte y para emitir haplotipos combinados exactos de indel/SNV/MNV observados en las mismas lecturas.

Para cómo se lee un indel a partir de los alineamientos, qué cuenta cada número de la salida, y cómo se descubren y reportan los haplotipos locales, mira Indels y haplotipos locales. Para si las variantes de un haplotipo van juntas de verdad, mira Ligamiento.

Compatibilidad con llamadores¶

Distintos llamadores pueden representar el mismo haplotipo local de maneras diferentes. Por ejemplo, FreeBayes se basa en haplotipos y puede emitir SNPs, indels, MNPs y eventos complejos como llamadas de haplotipo en bruto. Su propia documentación recomienda descomponer esas llamadas tras el llamado si se necesitan registros primitivos de SNP/indel.

bcftools norm se ocupa de la otra cara del problema: puede alinear a la izquierda y normalizar indels con una referencia FASTA, separar sitios multialélicos y atomizar variantes complejas o MNV en registros más simples. Ese paso de normalización resulta útil antes de comparar conjuntos de llamadas procedentes de distintos llamadores.

GATK HaplotypeCaller es un llamador, no un anotador. Recurre al ensamblaje local y a parámetros de genotipado como la ploidía de la muestra, el número máximo de haplotipos y la distancia de fusión de MNP. Por ahora, get_MNV no realiza este descubrimiento de haplotipos de novo ni el modelado de verosimilitud de genotipos.

Qué aporta get_MNV¶

Agrupación de SNVs por codón en filas SNP, MNV y mixtas SNP/MNV.
Normalización de inserciones/deleciones de iVar en alelos anclados compatibles con VCF.
Efectos proteicos de indels y alelos complejos a partir del feature seleccionado, la hebra, la fase del GFF y el offset proteico del transcrito.
Soporte derivado del BAM para observaciones individuales de SNP/MNV y para eventos exactos de indel o indel complejo.
Filas complex_indel adicionales solo cuando el haplotipo combinado completo de indel/SNV/MNV se observa en las lecturas del BAM.
Haplotipos locales leídos de las moléculas. Los eventos cercanos se agrupan en una ventana por proximidad, pero la proximidad solo propone: son las lecturas que cruzan esa ventana las que deciden qué combinaciones se reportan, y cada una sale con el número de moléculas que la llevan. Una combinación que ninguna lectura lleva no se emite, incluida la que es subconjunto de otra que sí se observa, porque una molécula con A, B y C no es evidencia de una molécula con solo A y B. Dos combinaciones que conviven de verdad salen las dos, cada una con su recuento. No hay tope al número de variantes que una ventana admite. Cada candidata se juzga sobre su propio tramo de referencia, y en el caso de una inserción ese tramo llega una base más allá del ancla, porque una inserción vive entre dos bases de referencia y una lectura que termina en el ancla no ha visto nada de la unión.

Reglas de límites¶

Las inserciones de VCF son eventos interbase anclados en la base de referencia anterior. Una inserción se considera que solapa un feature solo cuando la secuencia insertada cae entre dos bases de referencia dentro de ese feature. Una inserción anclada en la última base del feature queda fuera de él.

Las deleciones de VCF están ancladas, pero su efecto biológico es el tramo de referencia eliminado. Una deleción anclada justo antes de un CDS/gen afecta a ese feature siempre que las bases eliminadas lo solapen.

Cuando una fila MNV solapa un indel, get_MNV conserva la fila MNV como contexto posicional y marca su efecto en el aminoácido como Unknown con Change Type = Indel overlap. Si el BAM respalda el evento combinado completo, get_MNV emite por separado una fila exacta complex_indel.

El soporte exacto de indels complejos tiene en cuenta el CIGAR. Una lectura debe producir la misma secuencia ALT local y contener los componentes de inserción/deleción esperados. Esto importa en las combinaciones netamente neutras, donde una inserción más una deleción pueden producir la misma secuencia que un MNV simple bajo otro alineamiento.

Notas sobre CDS eucariota¶

Para anotaciones eucariotas GFF/GTF, usa --gff-features CDS de modo que get_MNV pueda aprovechar la fase del GFF y los identificadores de transcrito. Cuando las filas CDS llevan transcript_id o Parent, get_MNV construye un modelo de CDS empalmado para cada transcrito y evalúa la agrupación por codones, los efectos del MNV en el aminoácido y el contexto de frameshift del indel sobre esa secuencia codificante completa.

Esto implica que los codones repartidos entre uniones de exones se pueden anotar como un único MNV a nivel de transcrito, y los SNP aguas abajo se marcan como frameshift solo cuando el desplazamiento neto del indel codificante aguas arriba permanece fuera de marco. Las filas CDS sin un identificador de transcrito utilizable mantienen el comportamiento anterior por característica.

Limitaciones actuales¶

No se acepta un BCF de entrada directamente. Conviértelo antes con bcftools view.
El alineamiento a la izquierda de indels y la normalización completa no se realizan de forma automática salvo que --normalize-alleles logre recortar un prefijo o sufijo compartido. Para comparaciones entre llamadores, normaliza primero las entradas con una herramienta que tenga en cuenta el FASTA, como bcftools norm -f ref.fa.
Los genotipos, la ploidía, los conjuntos de fase y las verosimilitudes de genotipo no se vuelven a estimar. En datos eucariotas diploides/poliploides, interpreta con cautela los MNV heterocigotos sin fase a nivel de exón salvo que la evidencia del VCF o del BAM confirme que los alelos están en el mismo haplotipo.
El ensamblaje local de novo queda fuera del alcance. get_MNV solo combina alelos ya presentes en la entrada y, cuando es posible, confirmados por el soporte de lecturas del BAM.
El descubrimiento de haplotipos locales se limita a ventanas de eventos cercanos; la reconstrucción de haplotipos muy grandes debería seguir a cargo de un llamador dedicado.
El ensamblaje local completo sigue fuera del alcance: get_MNV reanota los alelos presentes en el archivo VCF/iVar de entrada en lugar de descubrir nuevas variantes candidatas.

Parámetros de ajuste¶

Estos flags modifican el comportamiento que tiene en cuenta los indels. Dos de ellos ya no adoptan por defecto el comportamiento original de la herramienta, porque ese comportamiento acertaba menos veces de las que fallaba: el cambio de marco solo se propaga desde un indel aguas arriba mayoritario, y la profundidad del locus del indel se cuenta desde la base ancla.

--frameshift-min-freq <0.0-1.0> (por defecto 0.5): frecuencia alélica mínima que un indel aguas arriba debe alcanzar para desplazar el marco de lectura de los codones SNV/MNV aguas abajo (el marcador (fs) y los tipos de cambio de frameshift). El valor por defecto propaga solo desde un indel mayoritario; pon 0.0 para propagar desde cualquiera. En poblaciones intrahospedador o mixtas, esto evita reetiquetar como frameshifted una sustitución de alta frecuencia aguas abajo a causa de un indel de baja frecuencia aguas arriba que casi con seguridad reside en otra molécula.

La frecuencia que se compara con el umbral es la que dan las lecturas cuando hay un BAM, que es el mismo número que se reporta como EFREQ. Solo sin BAM ocupa su lugar el AF declarado por el llamador. Importa porque muchos llamadores no escriben AF: mientras la puerta consultaba solo el valor declarado, una entrada así dejaba pasar todos los indels a cualquier umbral. Cuando se proporciona un BAM, la propagación además se fasea por lecturas: para cada indel aguas arriba y un SNV aguas abajo dentro del alcance de un read, se inspeccionan las lecturas que abarcan ambos loci, y el corrimiento de marco no se propaga a ese codón cuando las lecturas que llevan el SNV apenas llevan el indel (están en trans, en moléculas distintas). Es un refinamiento conservador que solo suprime (nunca añade propagación que el gate de frecuencia no haría), y solo aplica donde hay lecturas que abarcan ambos loci; más allá del alcance de un read sigue gobernando el gate de frecuencia. - --legacy-indel-depth (desactivado por defecto): restringe la profundidad del locus del indel (el denominador de EDP/EFREQ) a las lecturas que abarcan por completo el alelo REF. Por defecto se cuenta desde toda lectura que observe la base de anclaje, lo que evita el subconteo de profundidad y el sesgo de EFREQ que sufre una deleción de varias bases, donde las lecturas con solapamiento parcial quedan excluidas del denominador. Este flag recupera el denominador antiguo, más estrecho. - --count-mates-separately (desactivado por defecto): cuenta los dos mates de un fragmento como dos observaciones en vez de una molécula. Por defecto son una. Un fragmento es una sola molécula de ADN secuenciada por los dos extremos, así que contar los mates por separado cuenta dos veces el solape, y trata una variante en cada mate como si no tuvieran relación cuando de hecho es la prueba de que van juntas: un codón partido por un intrón puede quedar sin respuesta lectura a lectura y resolverse con el par. Donde los mates solapan y discrepan sobre una base, uno de los dos se equivoca y no hay forma de saber cuál, así que se considera que la molécula no observó esa posición. Los datos single-end no se ven afectados.

El descubrimiento de haplotipos locales también es a nivel de molécula: cada variante candidata se juzga sobre su propio tramo de referencia, así que un fragmento puede responder por una variante que cubre su primer mate y por otra que cubre el segundo. El conteo exacto del evento no lo es: una lectura tiene que reconstruir el alelo compuesto entero en una observación contigua, y eso no lo puede hacer ningún mate por separado. Un haplotipo local cuyas variantes caen en mates distintos se encuentra pero no se puede respaldar, y el umbral de soporte lo descarta en vez de reportarlo sin evidencia. - --phased-indel-min-reads <N> (por defecto 2) y --phased-indel-min-freq <0.0-1.0> (por defecto 0.0): soporte mínimo del BAM que una fila de haplotipo indel/complejo con fase debe reunir para ser emitida. Una ventana densa en datos intra-host puede albergar varias combinaciones genuinas a baja frecuencia; elevar estos valores deja solo las bien soportadas.

Cuando un indel con cobertura de lecturas no produce ningún soporte de CIGAR exacto, get_MNV emite una advertencia: por lo general, esto significa que el indel de entrada no está alineado a la izquierda del mismo modo que el BAM (algo habitual en homopolímeros y repeticiones en tándem). Normaliza antes la entrada con una herramienta que tenga en cuenta el FASTA (bcftools norm -f ref.fa) para que el alelo coincida con el alineamiento de las lecturas.

Referencias¶

FreeBayes: https://github.com/freebayes/freebayes
bcftools norm: https://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html#norm
GATK HaplotypeCaller: https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/30332006386459-HaplotypeCaller