Cómo funciona

Indels y haplotipos locales

Cómo lee get_MNV un indel a partir de los alineamientos, qué cuenta, y qué significa cada número de la salida. Para la compatibilidad con llamadores y las reglas de límites, mira Alcance y compatibilidad; esta página va de la lectura y del recuento.

Qué es un indel, posicionalmente#

Un indel de VCF está anclado. POS=100 REF=A ALT=AGG no cambia la posición 100: la A es relleno, y las GG se insertan entre la 100 y la 101. Una deleción POS=100 REF=AGG ALT=A conserva la 100 y elimina la 101 y la 102.

Eso tiene una consecuencia que get_MNV tiene que respetar en todas partes: una inserción no ocupa una base de referencia. Vive entre dos de ellas.

Qué tiene que ver una lectura antes de poder opinar#

Una lectura solo tiene derecho a opinar sobre un alelo si observó suficiente referencia como para tener una opinión. Ese tramo no siempre es el del propio alelo REF:

Una sola función responde a esto para todos los caminos que observan un alelo (observation_ref_len). Antes de existir, el conteo exacto, el descubrimiento de haplotipos y el fasing indel-contra-sustitución lo decidían por separado, y discrepaban. La peor combinación cancelaba soporte real: un mate que terminaba en el ancla de una inserción se leía como "aquí hay referencia" y anulaba el soporte que había aportado su pareja.

Soporte exacto del evento#

Event Reads cuenta moléculas que reproducen el alelo exactamente sobre su tramo de referencia, CIGAR incluido. Una lectura debe producir la misma secuencia local y contener los componentes de inserción y deleción esperados. Esto importa en combinaciones de efecto neutro, donde una inserción más una deleción pueden dar la misma secuencia que una sustitución simple bajo otro alineamiento.

Dos reglas mantienen honesto ese recuento:

• Una lectura cuya deleción se pasa de largo del tramo del alelo lleva una deleción más larga y distinta, y no es soporte de esta.
• Una molécula cuyos dos mates leen alelos distintos sobre el locus no respalda nada. Uno de los dos se equivoca y no hay forma de saber cuál, que es la misma postura que toma el conteo de sustituciones ante un solape contradictorio. Sin esto, un solo mate con un artefacto de alineamiento bastaba para acreditar la molécula entera, y el solape de mates es justo donde aparecen los artefactos de realineamiento de indels.

Event Depth es la profundidad del locus: por defecto, toda molécula que observe la base ancla con calidad suficiente. --legacy-indel-depth la restringe a las que cruzan el alelo REF entero, lo que infravalora la profundidad de una deleción multibase y sesga Event Frequency hacia arriba.

Haplotipos locales#

Cuando varias variantes caen cerca, la pregunta deja de ser qué hace cada una y pasa a ser cuáles comparten moléculas. get_MNV lo responde leyendo las moléculas, no enumerando posibilidades.

Descubrimiento: lo que enseñan las moléculas#

Las variantes cercanas se agrupan en una ventana por proximidad, pero la proximidad solo propone. Cada variante candidata se juzga sobre su propio tramo de referencia, así que un fragmento paired-end puede responder por una variante que cubre su primer mate y por otra que cubre el segundo. Una molécula que no observó todas las variantes de la ventana se aparta como parcial: lleva lo que lleva, pero meterla en una combinación afirmaría que le faltan las variantes que nadie miró.

Las moléculas que sí observaron la ventana entera se agrupan por la combinación que enseñan. Eso es la salida del descubrimiento, y es una distribución conjunta: cuántas moléculas son cada combinación.

De leer en vez de enumerar salen dos reglas:

• Una combinación que ninguna molécula lleva no se emite, incluida la que es subconjunto de otra que sí se lleva. Una molécula con A, B y C no es evidencia de una molécula con solo A y B.
• Dos combinaciones que conviven de verdad salen las dos, cada una con su recuento. Un esquema de enumerar y comprobar no puede distinguir eso de una sola molécula que lo lleva todo.

Recuento: cuántas moléculas son este haplotipo#

El soporte de una fila es el número de moléculas cuya combinación es exactamente esa, y sale del descubrimiento. El conteo exacto del alelo no puede responder a eso: empareja sobre el tramo de referencia de la propia combinación, así que una molécula que lleva esa combinación y algo más fuera del tramo también casa. Se queda con el trabajo que sí puede hacer, que es confirmar que el alelo es reproducible, y dar la profundidad de la ventana.

La diferencia no es académica. Con doce moléculas que llevan tres variantes y ocho que llevan solo las dos primeras:

Contada por coincidencia de alelo, la segunda fila decía 20 al 1.0000: el soporte de la especie entera, para un haplotipo que llevan ocho moléculas. Ahora los recuentos suman la profundidad, que es la imagen coherente de una ventana con dos especies.

Qué se emite#

• Los propios registros de la entrada, anotados como siempre.
• Una fila complex_indel por cada combinación que enseñan las moléculas, cuando tiene más de una variante y al menos una es un indel.
• Nada más. --phased-indel-min-reads (por defecto 2) y --phased-indel-min-freq (por defecto 0.0) ponen el suelo: una lectura no es evidencia de un haplotipo, porque un solo error de secuenciación en una posición llamada acuña su propia combinación.

Una ventana que enseña más de 64 combinaciones distintas reporta las mejor soportadas y dice en el log qué apartó, en vez de truncar en silencio.

Leer una fila de indel#

Para el ejemplo de arriba:

Positions          28
Variant Type       INDEL
Change Type        In-frame Indel
AA Changes         Ala10delinsSerLeu
Event Class        complex_indel
Event Components   SNV:28:G>T | INS:29:+GCT | SNV:30:T>A
Event Reads        12
Event Depth        20
Event Frequency    0.6000
SO Term            inframe_insertion
HGVS g.            g.28_30delinsTCGCTA

Positions es el ancla del alelo compuesto, no una posición por componente; en Event Components es donde se listan las partes. El cambio de aminoácido es el efecto del alelo compuesto entero, así que un haplotipo de tres variantes tiene una consecuencia proteica, no tres.

Una fila de MNV a nivel de codón que solapa un indel se conserva como contexto posicional con Change Type = Indel overlap y Unknown en el residuo, porque el efecto proteico del codón no está definido independientemente del indel. La fila complex_indel de al lado es donde está la consecuencia real.

Límites que conviene conocer#

• El conteo exacto necesita una observación contigua. El descubrimiento trabaja a nivel de molécula, así que un haplotipo con sus variantes repartidas entre mates se encuentra; el alelo no lo puede reproducir ningún mate por separado, así que la fila no se puede respaldar y el umbral la descarta.
• Un indel se empareja donde está escrito. En un homopolímero o una repetición en tándem, un indel de entrada colocado distinto que el alineamiento del BAM da soporte exacto cero, y un aviso lo dice. --left-align lo lleva a la posición equivalente más a la izquierda, donde los alineadores ponen el hueco, antes de contar nada (mira Alineamiento a la izquierda).
• Una inserción anclada en la última base de una feature queda fuera de ella, porque la secuencia insertada cae más allá. En un gen de hebra menos esa misma coordenada es la primera base del transcrito, así que la inserción cae en el 5' UTR. La misma regla, por la razón contraria.
• Sin ensamblaje de novo. get_MNV combina alelos que la entrada ya declara.
• Las deleciones y duplicaciones simbólicas se escriben a partir de la referencia. Desde la 1.1.6, un <DEL> (o un subtipo <DEL:...>) con END, o con SVLEN cuando falta END, pasa a ser la deleción explícita de POS+1 a END, y un <DUP> o <DUP:TANDEM> pasa a ser una copia en tándem de ese segmento insertada justo después de END. A partir de ahí se anota como cualquier indel: con o sin corrimiento de pauta, su cambio proteico, HGVS c. y el corrimiento que transmite aguas abajo. Los eventos de más de 10.000 bases, o que pasan del final del contig, siguen siendo simbólicos. El soporte de lecturas de un evento escrito se cuenta con las lecturas cuyo alineamiento lleva esa deleción o inserción exacta, que los alineadores de lecturas largas escriben y los de lecturas cortas casi nunca para eventos de este tamaño, así que con lecturas cortas espera Event Reads cerca de 0 y ajusta los filtros de lecturas teniéndolo en cuenta.
• Los demás alelos simbólicos (<INV>, <INS> sin secuencia, un <DEL> sin extensión) no tienen secuencia que una lectura pueda reproducir, así que la evidencia de lecturas no puede decir nada de ellos, y cuántas bases codificantes añaden o quitan es desconocido: la fila se reporta como coding_sequence_variant (MODIFIER) con efecto de aminoácido desconocido, en vez de darse por hecho que corre la pauta, y los codones que quedan por debajo en la misma feature se reportan también como desconocidos, por la misma razón. Resuelve el alelo a REF/ALT explícitos antes de ejecutar get_MNV si necesitas que se clasifique.

Cómo se comprueba esto#

• tests/scenarios/ construye alineamientos a mano para cada regla de arriba, incluidas las que solo muerden en un borde: una lectura que acaba en el ancla de una inserción, mates que discrepan sobre un indel, una deleción que se pasa de la declarada, y un haplotipo anidado dentro de otro.
• tests/truth/ barre una deleción y una inserción de 1 a 3 bases en cada posición de cada exón de cuatro genes, comprobando la consecuencia proteica contra una retraducción independiente.
• tests/pileup/ comprueba profundidad y hebra contra bcftools mpileup, que no lo ha escrito nadie de aquí.

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